0 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

редактирование генома

Комфортная антиутопия: как мир примиряется с генной модификацией людей

Двойняшки, которым запрограммировали иммунитет к ВИЧ на генетическом уровне, родились пять месяцев назад. Тогда научное сообщество раскритиковало подобные исследования. Теперь Всемирная организация здравоохранения призывает ученых поделиться опытом. За тем, как из антиутопии генная инженерия превращается в норму, наблюдают «Известия».

В ноябре 2018 Хэ Цзянькуй (He Jiankui), китайский ученый из Южного университета науки и технологий в Шэньчжэне, рассказал о рождении близняшек с измененным геномом. Чтобы защитить детей от ВИЧ, он был отредактирован во время беременности.

Задачей ученого было «отключить» ген CCR5, который связан с формированием белка, позволяющего вирусу попасть в клетку. Хэ работал с парами, в которых ВИЧ-положительными были только мужчины. Они принимали препараты и потому были незаразны. Геном был изменен в 16 эмбрионах, из них 11 были использованы для искусственного оплодотворения. Одна женщина в результате забеременела. Обе копии гена CCR5 удалось изменить лишь у одной из близняшек. У второй отредактирована одна копия, так что она может в будущем заразиться ВИЧ. Позже Хэ заявил, что еще одна женщина ждет ребенка с отредактированным геномом.

Об этой работе ученый рассказал на Втором международном саммите по генетическому редактированию человека в Гонконге. И хотя отдельные коллеги поддержали его исследования, большинство отнеслось к ним негативно.

Отредактированные дети

Ведущий конференции в Гонконге нобелевский лауреат Дэвид Балтимор (David Baltimore) назвал эксперимент безответственным. «Отключение» гена CCR5 повышает опасность заражения лихорадкой Западного Нила и другими вирусными заболеваниями, а также увеличивает вероятность смерти от гриппа. «Я не думаю, что в этом была медицинская необходимость. Список заболеваний [к которым в результате эксперимента снизилась сопротивляемость двойняшек], который был озвучен во время дискуссий, вызывает гораздо больше опасений», — заявил Балтимор.

Неприемлемым назвала эксперимент и Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna), одна из создательниц технологии редактирования генома CRISPR/Cas9, которую, предположительно, использовал Хе. Коллега Дудны Фэн Чжан также поддержал мораторий на имплантацию отредактированных эмбрионов.

Вскоре от исследований Хэ открестился его университет. На сайте появилось объявление о том, что он не ставил руководство в известность о своей работе. И вообще с февраля 2018 года по январь 2021-го находится в неоплачиваемом отпуске. Раздел, посвященный работе с детьми, на сайте лаборатории самого Хэ недоступен. И он не выпустил ни одной статьи об исследовании в рецензируемом научном журнале, хоть и говорил на конференции, что статья передана в одну из редакций. Так что все сведения об успехе эксперимента основаны на выступлении в Гонконге и интервью Associated Press. В университете, как и в больнице, которая якобы одобрила исследования, отметили, что шокированы произошедшим и проводят собственные расследования.

Непонятно и на чьи деньги проводился эксперимент. На саммите Хэ отказался отвечать на этот вопрос. Позже в одном из интервью сказал, что работа финансировалась на частные средства.

Финалом скандала стало заявление правительства Китая о запрете редактирования генома эмбрионов. Подобный запрет до этого был введен во многих странах. Из-за этого Китай и был выбран местом эксперимента Хэ и его бывшим научным руководителем, физиком и биоинженером Майклом Димом (Michael Deem) из Университета Райса в Хьюстоне.

Сюй Нанпин, вице-министр Китая по науке и технологиям

Эксперимент перешел грань морали и этики, которых придерживается академическое сообщество, и оказался шокирующим и неприемлемым.

Ген на милость

За пять месяцев, прошедших с тех пор, отношение к редактированию генома в научном сообществе изменилось. Резкое осуждение превратилось в острожный интерес.

Сторонники китайских опытов были с самого начала, пусть и в меньшинстве. Например, гарвардский генетик Джордж Черч (George Church), обративший внимание на то, что ВИЧ — растущая угроза для человечества. Или заведующий лабораторией эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН Сурен Закиян. По его словам, если заявления Хэ правда, «то это колоссальный прорыв для фундаментальной науки».

Тут надо отметить, что вопрос о том, реально ли Хэ достиг успеха, остается открытым. Все личные данные участников эксперимента конфиденциальны.

Больше того, вскоре после скандала выяснилось, что подобными исследованиями занимаются ученые во многих странах. В том числе в России с 2017 года в Национальном медицинском исследовательском центре имени Кулакова.

Денис Ребриков, заведующий лабораторией редактирования генома Национального медицинского исследовательского центра имени Кулакова

В рамках нашей исследовательской работы, продолжающейся с начала 2017 года, мы вносим в геном зиготы такую же модификацию, что и Хэ, с той лишь разницей, что мы не подсаживаем полученные эмбрионы пациенткам.

Отказ от выращивания эмбрионов с отредактированным геномом заведующий лабораторией редактирования генома Денис Ребриков объяснил тем, что побочные эффекты не изучены. И этически эта технология оправдана только для планирующих беременность ВИЧ-положительных женщин с плохим ответом на антиретровирусную терапию.

В феврале 2019 года в американском рецензируемом журнале Cell вышла статья о позитивном побочном эффекте редактирования генома. Тесты показали, что удаление у мышей того самого гена CCR5 улучшает их когнитивные (познавательные) функции. Также ученые выяснили, что люди, у которых CCR5 отсутствует из-за естественной мутации, быстрее восстанавливаются после инсульта.

Одна из авторов статьи, Альчино Сильва (Alcino Silva) из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе, подчеркнула, что последствия от такого воздействия известны пока только для мышей. Так что ученые сконцентрировались на разработке препаратов, которые смогут блокировать этот ген у пациентов, проходящих реабилитацию после инсульта.

В апреле авторы другого исследования побочных эффектов редактирования генома отозвали статью из британского научного журнала Nature Methods. За год с момента публикации ее несколько раз критиковали за некорректную постановку эксперимента. Ученые из Стэнфордского и Колумбийского университетов сравнивали мышей с отредактированным геномом с другими мышами той же линии (так называют группы искусственно выведенных мышей). И пришли к выводу, что мутацию, приводящую к слепоте, можно вылечить с минимальным количеством побочных эффектов. Научное сообщество, среди прочего, указало на то, что сравнивать подопытных нужно было с их родителями. В таком случае в геноме после тестов обнаруживается более 100 крупных мутаций. В новой публикации ученые признают, что их начальные выводы ошибочны. Однако с отзывом статьи согласились только двое из шести авторов.

Редактирование генома отдельных клеток с помощью системы CRISPR/Cas9 по всему миру продолжается. В Китае, где запретили менять геном эмбриона, пациентам вводят модифицированные лимфоциты в качестве иммунотерапии рака. Тестировать технологию по борьбе с этим заболеванием на 18 добровольцах начали в США еще в январе 2018 года. А на 2019 год в Соединенных Штатах и Европе запланировано начало клинических испытаний по редактированию стволовых клеток крови для лечения бета-талассемии и серповидноклеточной анемии (связанных с гемоглобином заболеваний).

Кстати, в Великобритании, где в 2016 году было разрешено в исследовательских целях редактировать геном эмбрионов человека, запрет после истории с китайскими двойняшками так и не был введен. И там в том же 2016 году на свет появился ребенок, родителями которого можно считать трех человек. Исследования, которые к этому привели, очевидно, велись до официального разрешения.

Российские ученые планируют заняться редактированием генома у живого человека в ближайшие три-четыре года, сообщила в августе прошлого года «РИА Новости» сотрудник лаборатории мутагенеза ФГБНУ «Медико-генетический научный центр», кандидат медицинских наук Светлана Смирнихина.

В феврале этого года Минобрнауки вместе с РАН разработали проект программы развития генетических технологий на 2019–2027 годы. Сделать это распорядился в ноябре 2018 года президент Владимир Путин. Тогда отмечалось, что программа нужна для ускорения развития генетических технологий и предупреждения чрезвычайных ситуаций биологического характера. А издание «Хайтек» отмечало, что в рамках этой программы откроют лаборатории по развитию технологии генетического редактирования.

Экономика против этики

Через несколько дней после того, как правительство Китая запретило редактировать геном эмбрионов, глава Всемирной организации здравоохранения Тедрос Адханом Гебрейесус призвал обсудить возможные последствия использования генной инженерии. И отметил, что надо начать обсуждение с того, стоит ли вообще подобное обсуждать, так как «есть большая часть населения, которая говорит: «Не надо это трогать».

И вот несколько дней назад эксперты ВОЗ пришли к выводу, что обсуждать, как и трогать, нужно. Они призвали создать регистр проводимых в мире исследований в сфере редактирования генов человека. И надеются на дискуссию с учеными, чтобы «лучше понять технические условия и нынешние мероприятия в сфере управления» исследованиями. Также ВОЗ будет проводить консультации с общественниками, группами пациентов, специалистами по этике и учеными в области социальных отношений.

Читать еще:  Как лечить тендинит ахиллова сухожилия?

По мнению профессора юриспруденции в Стэнфорде Хэнка Грили (Henry T. Greely), вопрос, когда ученым позволят улучшать людей, связан не столько с этикой, сколько с экономикой. Общественное мнение может измениться, если какая-нибудь крупная фармацевтическая компания начнет работать в этой сфере. И достаточно будет нескольких ярких маркетинговых кампаний под лозунгом «Мы изменим ваших детей», а также социологических опросов, посвященных праву родителей убирать возможные наследственные заболевания у потомков.

Правда, Грили полагает, что произойдет это нескоро. Пока технология CRISPR слишком сложна. И крупные игроки не будут заниматься незаконными исследованиями, чтобы спрогнозировать возможную выгоду.

Способствовать популяризации генной модификации могут и компании, не связанные с медициной. В декабре 2017 года Управление перспективных исследовательских проектов Минобороны США (DARPA) вложило $100 млн в разработку генетического оружия для борьбы с малярийными комарами, грызунами и другими видам животных, несущими угрозу человеку и окружающей среде. В ООН выступили с критикой этого проекта, так как уничтожение одних видов может оказать негативное воздействие на другие.

Есть успехи с CRISPR и у сельского хозяйства. Так, в Китае удалось создать свиней с пониженным содержанием жира после замены части генов генами мышей. А американская компания Monsanto планирует использовать CRISPR, чтобы вывести новые сорта растений, более урожайные и устойчивые к экстремальным условиями среды.

CRISPR, или короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами, обнаружили в Японии еще в 1980-е годы. Но догадались, как использовать особенности генома этой бактерии, только в 2010-е французские генетики Филипп Хорват (Philippe Horvath), Эммануэль Шарпентье (Emmanuelle Marie Charpentier) и их американская коллега Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna).

Отличие CRISPR/Cas9 от других способов генного редактирования в том, что изменения ДНК можно четко направлять. Раньше конструкцию клетки изменяли, не имея возможности предсказать, куда встанет новая последовательность. К тому же невозможно было изменить существующие свойства организма — только добавить новые.

В CRISPR/Cas9 есть специальный фермент, который разрывает нужно место в геноме. Cas в названии — это белок, участвующий в разрушении клеток. Когда организм начинает восстанавливать клетку, он ищет для этого нужные последовательности в соседних геномах. По технологии, клетка должна найти ее в ферментах, которые ввели в организм генетики.

Наука

Медицина

Расплести и переписать: создан новый метод редактирования генома

Новый метод редактирования ДНК спасет от 89% генетических болезней

Американские ученые разработали метод редактирования генома, более эффективный и безопасный, чем CRISPR–Cas9. Они рассчитывают с его помощью вылечить 89% генетических заболеваний.

Новый способ редактирования генома способен исправить 89% генетических ошибок, которые впоследствии могут вызвать заболевания, утверждают генетики из Гарварда. Статью, посвященную разработанному ими методу, исследователи опубликовали в журнале Nature.

Основная проблема распространенного сегодня метода редактирования генома CRISPR–Cas9 — частые ошибки и непреднамеренные эффекты. Для того, чтобы добиться лишь запланированных изменений в геноме, исследователи обратили внимание на обратную транскриптазу, фермент, участвующий в процессе образования ДНК на основе РНК. Новый метод ученые назвали первичным редактированием (prime editing).

В генной инженерии обратная транскриптаза используется для получения комплементарной ДНК — «зрелой» копии гена, не содержащей интронов, участков, которые есть в только-только образовавшейся ДНК.

CRISPR–Cas9 в ходе своей работы «разрезает» обе нити двойной спирали ДНК, вносит в ее структуру необходимые изменения и «склеивает» их обратно.

С помощью специально разработанной удлиненной гидовой РНК исследователи добились того, чтобы разрезанной была только одна нить.

Гидовая ДНК защищает нить ДНК, позволяя «расплести» нити и редактировать только одну из них.

Затем с помощью обратной транскриптазы формируется новый участок ДНК. Информация о том, каким он должен быть, хранится в той самой удлиненной РНК. В результате получаются две копии одного участка ДНК. Одну из них, как правило старую, разрушают внутриклеточные нуклеазы. Новая же «вшивается» на ее место.

В ДНК присутствуют четыре вида азотистых оснований, которые соединяются между собой по принципу комплементарности: аденин — с тимином, гуанин — с цитозином. После изменения одной из цепей этот принцип нарушается и репаративным белкам приходится расщепить одну из них и перестроить заново. Еще одна РНК, добавленная в систему, наводит Cas9 на необходимую цепь и он создает в ней разрывы. Тогда белки принимают ее за ошибочную и перестраивают по подобию уже измененной.

Исследователи проводят аналогию с работой в текстовом редакторе — сначала выполняется поиск необходимого фрагмента, затем он удаляется, а на его место вставляется новый.

«Первичное редактирование можно сравнить с текстовыми процессорами, способными искать необходимые последовательности и с точностью заменять их. Наш метод предлагает большую гибкость и высокую точность редактирования», — говорит доктор Дэвид Лью, один из авторов работы.

Исследователи протестировали свою разработку на нескольких типах человеческих клеток.

До 50% попыток оказывались успешны, CRISPR/Cas9 же в аналогичных экспериментах справлялся лишь в 10% случаев.

Частота ошибочных вставок или потерь участка хромосомы не превышала 10% в зависимости от типа клеток. В частности, в зрелых нейронах ошибки при использовании первичного редактирования возникали в 0,58% случаев. При использовании CRISPR/Cas9 — в 31%.

Культуры клеток удалось «вылечить» от болезни Тея — Сакса, при которой вскоре после рождения ребенок из-за нарушения работы нервной системы теряет зрение, слух, способность глотать, страдает от паралича и к четырем годам обычно погибает. Причина болезни — четыре дополнительных азотистых основания, от которых исследователям и удалось успешно избавиться.

Также они разделались с серповидной клеточной анемией и предрасположенностью к прионным инфекциям.

Существует около 75 тыс. мутаций, способных вызывать у людей различные заболевания. По оценкам Лью, первичное редактирование способно исправить 89% из них. Остальные случаи приходятся на нехватку целого гена или, наоборот, избыток его копий.

Пока что исследования нового метода только начинаются, но ученые уже весьма вдохновлены результатами.

«Первичное редактирование — это не конец, а лишь начало в попытках изменять ДНК в любой части клетки или организма, в том числе и для борьбы с генетическими заболеваниями», — говорит Лью.

Поскольку подавляющее большинство генетических заболеваний человека связано с типами мутаций, которые может исправить с помощью такого редактирования, мы надеемся, что этот метод будет полезен, — комментирует работу профессор Робин Ловелл-Бэдж из Института Фрэнсиса Крика. — Разумеется, потребуется гораздо больше работы для оптимизации метода, прежде чем его можно будет использовать в клинической практике для лечения пациентов, но он, безусловно, выглядит многообещающе».

Редактирование генома с CRISPR/Cas9

Об иммунной системе бактерий, механизме действия CRISPR/Cas9 и результатах редактирования генома человеческих эмбрионов

Sébastien Thibault

В начале 2013 года несколько групп ученых показали, что системы CRISPR/Cas могут работать не только в клетках бактерий, но и в клетках высших организмов, а значит, CRISPR/Cas-системы дают возможность исправлять неправильные последовательности генов и таким образом лечить наследственные заболевания человека.

Открытие иммунной системы бактерий

Никто не мог предположить, что практическая возможность лечить генетические болезни человека появится «благодаря» бактериям. В конце 80-х годов японские ученые частично секвенировали геном кишечной палочки и нашли интересный участок, который ничего не кодировал. Этот участок содержал повторяющиеся последовательности ДНК, разделенные вариабельными участками — спейсерами. Наличие протяженного некодирующего участка удивило японцев, так как бактерии экономно относятся к своей ДНК и обычно не несут лишних последовательностей. Позже подобные «кассеты» повторов и спейсеров найдут у большого количества бактерий и архей и назовут CRISPR.

Для бактерий одного вида характерно наличие многочисленных штаммов, которые часто сильно отличаются друг от друга. В некотором смысле штаммы можно рассматривать как аналог рас или пород животных. Один штамм одного и того же вида бактерии может быть совершенно безобидным, а другой — опасным патогеном. У разных штаммов бактерий обнаружилась вариабельность, или полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах. Это свойство, значение которого было совершенно неизвестно, стало широко использоваться для типирования штаммов и эпидемиологического анализа. В частности, компания Danisco, занимающаяся производством заквасок для молочной промышленности, стала использовать это свойство для классификации своих коммерческих штаммов. Это было удобно и из патентных соображений, ведь несанкционированное использование типированных штаммов Danisco можно было легко выявить и засудить нарушителей.

В начале 2000-х годов несколько ученых независимо друг от друга сравнили последовательности известных CRISPR-спейсеров с последовательностями ДНК, депонированными в публичные базы данных. Оказалось, что довольно часто последовательности спейсеров были похожи на последовательности вирусов. Это позволило предположить, что CRISPR-кассеты могут нести защитную функцию. Результаты были опубликованы в журналах, находящихся в нижней части научной «табели о рангах», и в общем мало кого заинтересовали. Тогда же были обнаружены Cas-гены, часто расположенные рядом с CRISPR-кассетами. Группа биоинформатика Евгения Кунина предложила довольно детальную гипотетическую схему механизма действия CRISPR/Cas-систем. Согласно их модели, при попадании вируса в клетку он обнаруживается с помощью белка Cas, использующего синтезированную c CRISPR РНК-копию. Если какой-либо фрагмент генома вируса совпал с записанным в спейсере, Cas разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате вся ДНК уничтожается.

Читать еще:  Соцсеть «Вконтакте» объявила войну антипрививочникам

При промышленном производстве кисломолочных продуктов вирусы-бактериофаги, случайно попадающие в ферментеры (огромные чаны с молоком и внесенными туда молочнокислыми бактериями), нарушают ферментацию, что приводит к огромным убыткам. Для того чтобы этого избежать, нужно использовать устойчивые к вирусам бактерии. Вывести такие бактерии просто: достаточно в лабораторных условиях отобрать клоны бактерий, способные к росту в присутствии вируса. Эту процедуру и провели в компании Danisco, но при выборке заметили одну важную особенность. Оказалось, что в CRISPR-кассетах клонов, ставших устойчивыми к вирусу, появлялись новые спейсеры, соответствовавшие участкам вирусного генома. Тогда ученые провели прямой эксперимент и методами молекулярной генетики вставили спейсер с последовательностью ДНК вируса в CRISPR-кассету бактерии. И такая генно-модифицированная бактерия действительно оказалась устойчивой к вирусу. Эти результаты были опубликованы в журнале Science в 2007 году и были первым экспериментальным подтверждением защитного действия CRISPR/Cas-систем, опосредованного последовательностями спейсеров. Немногим позже в Science была опубликована статья группой Джона ван дер Ооста (prof. dr. John van der Oost) «CRISPR-Cas Systems: RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea», в которой показывалось, что система действительно работает через малые CRISPR РНК. Статья была выпущена в соавторстве с группой Кунина.

Разработка технологии CRISPR/Cas9

Исходные системы, предсказанные в группе Кунина и другими учеными, кодировали большое количество Cas-белков, необходимых для бактериальной защиты. Но также был обнаружен класс систем, которые кодировали только один Cas-белок, правда очень большой. Защитное действие таких систем было продемонстрировано французской исследовательницей Эммануэль Шарпентье. Если в стандартных системах несколько белков собираются в сложный комплекс, связывающий CRISPR РНК, а затем этот комплекс узнает вирусную ДНК-мишень и привлекает еще один белок, «кусающий» вирусную ДНК, то в системе, которую повезло изучать Шарпентье, один белок, получивший название Cas9, выполняет все эти функции: и связывает CRISPR РНК, и узнает мишень, и «раскусывает» ее.

В 2012 году группы Шарпентье и Дженнифер Дудны из Университета Беркли опубликовали совместную статью в Science, где предложили способ перепрограммирования системы CRISPR/Cas таким образом, чтобы она стала направленно разрезать ДНК в участках, целенаправленно выбранных исследователем. В природе CRISPR РНК кодируется в CRISPR-кассете, связывается белками и потом узнает мишень. Оказалось, что можно получать неприродную CRISPR РНК с помощью химического или ферментативного синтеза. При этом место спейсера в такой РНК занимает последовательность, выбранная исследователем. Белок Cas9 способен «узнать» и связаться с такой синтетической СRISPR РНК (ее называют «гид») и становится запрограммированным на узнавание и разрезание соответствующего ей места в ДНК. Группы Шарпентье и Дудны продемонстрировали возможность такого подхода in vitro, то есть в пробирке.

Практически в это же время группы Джорджа Черча и его бывшего аспиранта Фенга Жанга (Feng Zhang) из Института Броуда в MIT показали, что бактериальный белок Cas9 и гид РНК способны «работать», узнавать и направленно разрезать ДНК в клетках высших организмов, в частности человека. MIT успел подать заявку на патент на день раньше, чем Беркли. С тех пор между двумя университетами начались патентные войны, которые продолжаются до сих пор.

Механизм геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9

Мы диплоиды. Это значит, что у нас двойной набор хромосом — по одному от папы и мамы. Если одна из родительских хромосом «неправильная», то есть в ней изменена последовательность ДНК в каком-то важном гене, может возникнуть состояние носительства генетической болезни, а если обе копии неправильные — возникнет генетическая болезнь. Классический пример — гемофилия у царевича Алексея Романова. Его бабка Виктория передала ему неправильную копию гена на X-хромосоме, хотя сама от гемофилии не страдала, потому что у нее две X-хромосомы и вместо дефектной работала здоровая хромосома. А Алексею не повезло, ведь у него только одна Х-хромосома.

Для того чтобы вылечить генетическую болезнь, нужно исправить генетическую информацию, затронутую мутацией. Гемофилия, как и большинство генетических болезней, вызвана изменением только одной буквы ДНК, а всего в нашем геноме 6 миллиардов букв. Это тысячи книг размером с «Войну и мир». Мы должны найти только одну «опечатку» и исправить ее в заданном месте, не изменив ничего больше. Это и есть задача геномной медицины.

Чтобы исправить «неправильный» ген, нам нужен очень точный молекулярный «скальпель», который найдет мутантную последовательность нуклеотидов и сможет «вырезать» ее из ДНК. Таким «скальпелем» и является Cas9. С помощью гида РНК, последовательность которой совпадает с искомым местом, он может внести разрыв в нужное место генома. Узнавание мишени происходит на участке длиной в 20–30 нуклеотидов. В среднем последовательности такой длины встречаются в геноме человека единожды, что позволяет обеспечить точность. Клетка не умрет от внесения разрыва в ДНК, так как он будет исправлен по здоровой копии из парной хромосомы за счет естественного процесса репарации ДНК. Если парной хромосомы нет, как в случае гемофилии, можно внести в клетку участок «правильного» гена одновременно с Cas9 и РНК-гидом и использовать его как матрицу для залечивания внесенного разрыва.

С помощью CRISPR/Cas9 можно делать мультиплексное редактирование сразу нескольких неправильных генов. Для этого достаточно ввести белок Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из них направит Cas9 к собственной мишени, и вместе они устранят генетическую проблему.

В целом описанный механизм функционирует за счет принципа комплементарности, который впервые был предложен Джимом Уотсоном и Френсисом Криком в их знаменитой модели двуцепочечной ДНК. Цепочки двойной спирали ДНК «узнают» друг друга по правилам комплементарности. CRISPR РНК узнает свои мишени в двуцепочечной ДНК таким же образом, при этом образуется необычная структура, содержащая двуцепочечный участок взаимокомплементарных РНК и одной из цепей ДНК-мишени, а другая цепь ДНК оказывается «вытесненной».

Системы ZFNs и TALENs

Параллельно с системой CRISPR/Cas9 развивались и другие подходы к редактированию генома, а именно с помощью TALEN-белков и белков с так называемыми цинковыми пальцами. Это генно-инженерные белки, которые могут «кусать» ДНК. Ученые пытались научить их узнавать специфическую, в идеале — любую заданную последовательность ДНК. Иногда это работало, но для каждой последовательности приходилось создавать свой отдельный белок, а это кропотливая и долгая работа. Для редактирования же генома с помощью системы CRISPR/Cas9 используется единственный белок, а РНК-гид можно создать за короткое время в любой приличной лаборатории или просто купить. Это совершенно новый уровень редактирования, дешевый и точный. Его основное преимущество в том, что он основан на простом принципе комплементарного узнавания, который используется для узнавания последовательности одних нуклеиновых кислот с помощью других, комплементарных нуклеиновых кислот.

CRISPR/Cas9 в лечении наследственных заболеваний

В первую очередь с помощью CRISPR/Cas9 мы сможем лечить «простые», моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию. В этих случаях понятно, что именно нужно отредактировать, но существуют заболевания с высокой наследуемостью, генетическая природа которых очень сложна. Такие болезни — сложный результат взаимодействия разных генов и их вариантов. Например, многие ученые ищут гены шизофрении и алкоголизма, каждый год находят новые, каждый год часть ранее отрытых генов оказывается ни при чем. Как лечить такие сложные болезни с помощью CRISPR/Cas9 — непонятно, и, очевидно, потребуются мультиплексные подходы.

Надо понимать, что практическое применение CRISPR/Cas9 в медицине — это скорее отдаленное будущее, потребуется еще масса работы, улучшения технологии, ее надежности и безопасности. В целом ситуация с болезнями крови лучше, так как испорченный ген нужен только для кроветворения, а технологии клеточной терапии для таких болезней хорошо отработаны. Предположим, человек болеет лейкемией. Сейчас, для того чтобы устранить болезнь, его облучат, найдут подходящего донора и пересадят костный мозг. Донора искать долго, а полного иммунологического соответствия никогда не бывает.

Редактирование генома. Человек против эволюции.

Технология CRISPR — это простой, но мощный инструмент для редактирования генома . Он позволяет легко изменять последовательности ДНК и функцию генов. Его потенциальные применения включают в себя исправление генетических дефектов, лечение и предотвращение распространенных болезней и даже улучшение урожая . Однако, использование данной технологии вызывает ряд этических вопросов.

Читать еще:  Осенне-зимняя депрессия, или как бороться с этой невыдуманной болезнью

CRISPR (полное название CRISPR-Cas9 ) — это специализированные участки ДНК. Фермент Cas9 — это пара молекулярных ножниц, которые могут вырезать нити ДНК.

Технология CRISPR была создана на подобии защитных природных механизмов бактерий архей — одноклеточных микроорганизмов. Эти организмы используют полученную РНК и белки Cas9 для борьбы с вирусами и инородными телами, измельчая и уничтожая ДНК захватчика. Когда такие компоненты переносятся на другие, более сложные организмы, это позволяет «манипулировать» генами и редактировать их.

CRISPR — дословно означает » кластеры регулярных промежуточных коротких палиндромных повторов «. Это специализированная область ДНК, состоящая из прямых повторяющихся последовательностей, разделенных уникальными последовательностями — спейсерами . Повторяющиеся последовательности нуклеотидов — структурные блоки ДНК — распространяются по всей области CRISPR.

В случае бактерий, спейсеры берутся из вирусов, ранее атаковавших организм. Они служат неким банком воспоминаний, благодаря которому бактерии распознают вирусы и борются с будущими атаками.

Впервые это экспериментально продемонстрировала группа исследователей из Danisco — компании, которая производит пищевые ингредиенты. Согласно публикации в журнале Science , исследователи использовали бактерии Streptococcus thermophilus , которые встречаются в йогурте и других молочных продуктах. Ученые отметили, что после вирусной атаки в область CRISPR были включены новые спейсеры . Последовательность ДНК этих спейсеров была идентична части генома вируса. Они манипулировали этими спейсерами, «вынимая» их или вводя новые вирусные последовательности. Таким образом, появилась возможность изменять устойчивость бактерий к атаке определенного вируса. Ученые подтвердили, что CRISPR играет важную роль в регулировании бактериального иммунитета .

РНК CRISPR (crRNA) — после включения спейсера и повторного заражения, вирусная часть CRISPR транскрибируется и обрабатывается в РНК CRISPR . Нуклеотидная последовательность CRISPR является «шаблоном» для получения комплементарной последовательности одноцепочечной РНК. Каждая РНК состоит из нуклеотидного повтора и спейсерной части.

Cas9 — белок Cas9 представляет собой фермент, который «режет» чужую ДНК.

Белок обычно связывается с двумя молекулами РНК — crRNAb и tracrRNA (транс-активирующая crRNA). Затем Cas9 направляется туда, где его будут вырезать. Это место ДНК является комплементарным 20-нуклеотидному участку crRNA.

Используя две отдельные области в своей структуре, Cas9 разрезает обе нити двойной спирали ДНК — это называется двухцепочечным разрывом .

Существует встроенный механизм безопасности , который гарантирует, что Cas9 не разрежет ничего в ненужном месте. Короткие последовательности, или РАМ (последовательность, прилегающая к протоспейсеру), являются метками и располагаются с целевой ДНК-последовательностью. Если Cas9 не видит РАМ рядом с его целевой последовательностью ДНК, он не будет вырезаться. Это одна из причин, почему Cas9 никогда не атакует регион CRISPR в бактериях.

CRISPR-Cas9 как инструмент для редактирования генома

Геном различных организмов кодирует серию сообщений и инструкций в своих последовательностях ДНК. Редактирование генома включает в себя изменение этих последовательностей. Это можно сделать разрезав ДНК, обманывая механизмы восстановления естественной ДНК клетки, внося изменения , которые вы захотите . CRISPR-Cas9 предоставляет все средства для этого.

В 2012 году в журналах Science и PNAS были опубликованы две научные статьи, которые помогли превратить бактериальный CRISPR-Cas9 в простой, программируемый инструмент для редактирования генома.

Исследователи из разных групп пришли к выводу, что Cas9 может быть направлен на вырезание любой области ДНК. Это можно сделать, изменив нуклеотидную последовательность сrRNA , которая связывается с дополнительной целью ДНК. Ученые упростили систему, путем слияния crRNA и tracrRNA, чтобы создать единую «руководящую» РНК. Отсюда следует вывод, что для редактирования генома требуются только два компонента — руководящая РНК и белок Cas9 .

«В оперативном плане вы составляете участок из 20 нуклеотидных пар оснований, которые соответствуют гену, который вы хотите отредактировать», — Джордж Черн , профессор генетики в Гарвардской медицинской школе . «Важно обеспечить то, чтобы нуклеотидная последовательность была обнаружена только в целевом гене и нигде больше в самом геноме. Тогда РНК и белок Cas9 будет вырезать как ножницами ДНК на этом участке и нигде более».

После того, как ДНК вырезана, естественные механизмы восстановления клетки активируются и начинают работать над выведением мутаций и других изменений в геноме. Это может происходить двумя способами. Согласно проекту в университете Стэндфорда , один метод включает склейку двух урезаний вместе. Этот метод, называющийся » негомологичное соединение концов «, как правило, позволяет избежать ошибок. Нуклеотиды, случайно вставленные или удаленные, в результате мутаций могут нарушить ген. Во втором методе разрыв фиксируется путем заполнения зазора последовательностью нуклеотидов. Для этого клетка использует короткую нить ДНК в качестве шаблона. Ученые могут подать шаблон ДНК по своему выбору, тем самым, записывая любой ген, который захотят, или исправляя мутацию.

CRISPR-Cas9 стал популярным в последние годы. Данная технология проста в применении и в четыре раза эффективнее, чем предыдущий, устаревший инструмент для редактирования генома (TALENS).

Исследования, проведенные с использованием лабораторных животных с человеческими заболеваниями, продемонстрировали то, что технология может быть эффективна для коррекции генетических дефектов . Примерами таких заболеваний являются кистозный фиброз, катаракта и анемия. Эти исследования прокладывают путь для терапевтического применения у людей.

«Я думаю, что общественное восприятие CRISPR очень сфокусировано на идее использования генетического редактирования для лечения болезней», — говорит Невилл Санджана из New York Genome Center , доцент кафедры биологии, нейробиологии и физиологии. «Это без сомнения, захватывающая возможность, но это только одна маленькая часть из всех возможностей».

Технология CRISPR также применялась в пищевой и сельскохозяйственной промышленности для разработки пробиотических культур и для вакцинации промышленных культур против вирусов. Она используется в сельскохозяйственных культурах для повышения урожайности, засухоустойчивости и улучшения питательных свойств.

Еще одно потенциальное применение — создания » генного драйва «. Это генетические системы, которые увеличивают вероятность того, что конкретный признак переходит от родителя к ребенку. В течении поколений, признак распространится по всем потомкам. Генный драйв может помочь в борьбе с распространением таких заболеваний, как малярия, путем стерильности среди векторов болезни — москитов. Кроме того, они могут быть использованы для искоренения инвазивных видов и обратного воздействия пестицидов и гербицидов.

Однако CRISPR-Cas9 не лишен недостатков . Он не эффективен на 100 процентов. Более того, эффективность редактирования генома может меняться. В исследовании, проведенном на рисе, редактирование генов произошло почти в 50 процентах клеток, которые получили комплекс Cas9-РНК. А другие анализы показали, что в зависимости от цели, эффективность редактирования может достигать 80 и более процентов.

Существует также » феномен эффектов вне цели «, где ДНК разрезается в местах, отличных от намеченной цели. Это может привести к появлению непреднамеренных мутаций. Кроме того, что даже если система режет по цели, есть вероятность, получить не точное редактирование. Этому дали название » геном-вандал «.

Многие потенциальные применения технологии CRISPR вызывают вопросы об этических достоинствах и последствиях переделки генов.

У использования генного драйва есть потенциальное экологического воздействие. Введенное изменение может распространятся за пределы целевой популяции на другие организмы путем скрещивания. Генные драйвы также могут уменьшить генетическое разнообразие целевой популяции.

Создание генетических модификаций человеческого эмбриона и репродуктивных клеток, таких как сперма и яйцеклетка, известно, как редактирование зародышевой линии . Поскольку изменения этих клеток может передаваться по наследству, использование технологии CRISPR для внесения изменения в зародышевую линию вызывает ряд этических проблем .

Изменчивая эффективность, нецелевые эффекты и неточные изменения создают риски для безопасности. Редактирование зародышевой линии повышает вероятность непредвиденных последствий для будущих поколений, поскольку мы еще ограничены в знаниях о генетике человека, взаимодействиях между генами и окружающей средой и путями заболевания.

Другие этические проблемы довольно тонки . Должны ли мы вносить изменения, которые могут кардинально повлиять на будущие поколения без их согласия? Что делать, если использование редактирования зародышевой линии сводится к тому, чтобы улучшить различные характеристики человека?

Пока редактирование генов будет производится только для исцеления от серьезных заболеваний, и только тогда, когда нет альтернативного лечения. Но для этого необходимо собрать максимальное количество данных о рисках и преимуществе процедуры для здоровья. Также необходим полный контроль во время клинических испытаний.

И напоследок, некоторые последние исследования:

◾️ В 2017 году группа ученых выпустила исследование в журнале Science о том, что они запрограммировали молекулу CRISPR для поиска штаммов вирусов , таких как вирус Зика, в сыворотке крови, моче и слюне.

◾️ 2 августа 2017 года в журнале Nature были опубликованы результаты работы, где говорилось об успешном удалении дефекта сердца у эмбриона используя CRISPR.

◾️ 2 января 2018 года ученые объявили, что могут останавливать грибок , который угрожает в производстве шоколада. CRISPR использовался, чтобы сделать растения более устойчивыми к болезням.

◾️ 16 апреля 2018 года в журнале BioNews было опубликовано исследование, в котором ученые объявили о редактировании тысяч генов одновременно, используя CRISPR.

Ссылка на основную публикацию
Статьи c упоминанием слов:
Adblock
detector