1 просмотров
Рейтинг статьи
1 звезда2 звезды3 звезды4 звезды5 звезд
Загрузка...

Разработан новый способ замораживания живых тканей

Разработан новый способ замораживания живых тканей

Исследователи американского университета Миннесоты разработали новый способ разморозки органов без их повреждения. Работа ученых опубликована Science Translational Medicine, а краткое ее изложение приводится в сообщении университета. Разработанный исследователями способ позволяет равномерно прогревать замороженный орган со скоростью от ста до двухсот градусов Цельсия в минуту. Это в десятки раз быстрее современных способов разморозки.

Криогенная заморозка, или криоконсервация, считается наиболее перспективным способом сохранять донорские органы.

Для замораживания донорские органы помещают в специальный раствор — криопротектор. Криогенная заморозка, или криоконсервация, считается наиболее перспективным способом сохранять донорские органы. Для замораживания донорские органы помещают в специальный раствор — криопротектор. Обычно он изготавливается на основе глицерина или пропиленгликоля. Этот раствор предупреждает образование кристаллов льда, способных повредить клетки органа и сделать его непригодным для дальнейшего использования. Криоконсервация производится при температуре −196 градусов Цельсия в жидком азоте.

Криоконсервация пока используется для замораживания спермы, клеточных культур или преимплантационных эмбрионов. Крупные органы или живые организмы замораживаются относительно редко, поскольку пока не существует надежного способа их безопасной разморозки. Дело в том, что при медленной разморозке переохлажденные органы покрываются кристалликами льда, повреждающими ткани. Если же прогрев ускорить, то органы из-за перепада температур внутри и снаружи просто трескаются.

Новый способ, разработанный американскими учеными, предполагает добавление в раствор-криопротектор наночастиц оксида железа, покрытого пористым диоксидом кремния. Этот материал способен быстро нагреваться под воздействием электромагнитного излучения. Благодаря равномерному размешиванию наночастиц в криопротекторе можно обеспечить их проникновение внутрь донорского органа и при разморозке быстро и равномерно прогревать последний.

Во время экспериментов исследователи использовали крупные сердечные клапаны и кровеносные сосуды животных, подвергнутые криоконсервации в растворе VS55 с добавлением новых наночастиц. Впоследствии для разморозки использовалась установка с индукционной катушкой. Мощность установки составляла от одного до 15 киловатт и изменялась сменой индукционной катушки. Киловаттная мощность использовалась для разморозки образцов в контейнерах объемом один миллилитр, а 15-киловаттная — в 80 миллилитровых контейнерах.

При размораживании катушка генерировала электромагнитное излучение с частотой от ста до 400 килогерц. В ходе эксперимента криоконсервированные образцы были быстро разморожены. Исследование с помощью микроскопии показало, что образцы не получили клеточных повреждений. Контрольные быстрая конвективная и медленная разморозки показали худшие результаты, некоторые из образцов были повреждены.

После успешной разморозки образцы были промыты и проверены на отсутствие наночастиц оксида железа. Контроль ультразвуковым исследованием и магнитно-резонансной томографией наночастиц после промывки образцов не выявили.
В феврале прошлого года исследователи из компании 21st Century Medicine сумели разморозить мозг кролика и свиньи после криоконсервации, сохранив при этом нейронные связи. Для заморозки органов ученые использовали новый метод, получивший название альдегид-стабилизированной криоконсервации. Перед криоконсервацией в мертвый мозг животных подавали фиксирующий раствор на основе глутарового альдегида и криопротектор с добавлением этиленгликоля. Затем мозг животных охладили до −135 градусов Цельсия.

Затем исследователи разморозили мозг животных, удалили фиксирующий раствор и криопротектор, и проанализировали состояние мозга с помощью электронной микроскопии. Оказалось, что замораживание и последующее размораживание не повлияло на микроструктуру синапсов. Они остались нетронутыми. Исследователи полагают, что в перспективе это позволит проводить криоконсервацию мозга с сохранением долговременной памяти.

Холодные игры: найдена позволяющая вернуться к жизни технология заморозки

Российская компания предложила метод «акустической заморозки» веществ и тканей. Он открывает новые перспективы для криопациентов — людей, замороженных после смерти в надежде, что ученые найдут способ вернуть их к жизни. У одной из отечественных компаний уже 64 таких «клиента».

Технология крионики стала результатом прогресса в области биологии, обозначившего теоретическую достижимость замораживания только что умершего человека с последующим его «воскрешением» в далеком будущем. Благодаря развитию реаниматологии стало ясно, что смерть не мгновенный акт, а сложный многоуровневый процесс, некоторые стадии которого являются обратимыми. Это позволило сформулировать суждение о теоретической возможности оживления человека, замороженного в течение достаточно долгого промежутка времени.

— Крионировав умершего человека, хуже мы не сделаем, — говорит президент фонда «Наука за продление жизни» Михаил Батин. — Я захотел сохранить мозг своего деда, чтобы имелся шанс восстановить его личность. При хорошем стечении обстоятельств прогресс не остановится, возникнут технологии восстановления тканей и органов, переноса создания в другое тело — возможно, искусственное. И многие люди смогут жить снова.

Энтузиасты полагают, что технологии будущего позволят восстанавливать незначительно поврежденные клетки, которые еще не затронул процесс разложения. Чем меньше они повреждены, тем больше шансов на их успешное оживление, говорят сторонники крионики. Проблема в том, что заморозка, даже очень быстрая, повреждает живые ткани. Крохотный эмбрион или сперматозоид можно заморозить в доли секунды, тогда лед не успеет кристаллизоваться и повредить живые ткани. Но макрообъекты вроде человеческих тел быстро охладить нельзя.

Ученые обратились к этой проблеме еще в середине прошлого столетия и нашли вещества, препятствующие образованию льда внутри клетки, — их называют криопротекторами. Ими пытаются заменить внутриклеточную воду.

Путевка в будущее

Некоторые животные, например древесные лягушки, сами вырабатывают криопротектор глицерин — таким образом они переживают холодную зиму в замороженном состоянии, а весной оттаивают. Но для человека глицерин в больших количествах токсичен.

Однако с понижением температуры криопротекторы значительно теряют свою токсичность. Поэтому сегодня технология заморозки тел людей и животных осуществляется следующим образом: человека (после фиксации юридической смерти) охлаждают с помощью обычного льда до температуры 1–2°C. Затем его кровь в несколько этапов замещают смесью криопротекторов — этот процесс называют перфузией. Сначала вводят смесь обогащенной солями воды и глицерина в соотношении 2:3, добавляя 130 г глюкозы, которая помогает клеткам не терять воду и сохранять химическое равновесие на этапе, пока внеклеточная жидкость заменяется глицерином. В дальнейшем долю глицерина увеличивают постепенно, пока он не заменит собой всю воду.

Потом тело помещают в спальный мешок, обкладывают сухим льдом и охлаждают до –78°C. На финальном этапе пациента кладут в особый контейнер, где с помощью жидкого азота температуру тела постепенно понижают до –196°C, и перемещают в хранилище, где такая низкая температура поддерживается постоянно.

Спасительная волна

Идея совместить звуковую волну с охлаждением возникла у основателей российской компании «Акустическая заморозка». Они создали установку, которую можно совместить с обычным морозильником. При воздействии новым методом образующиеся ледяные кристаллы получаются в 100 раз меньше, чем при шоковой заморозке: они не разрастаются и не соединяются между собой, поэтому ткани замораживаемой субстанции остаются практически неповрежденными.

Читать еще:  Ямочки на щечках: патология или эталон красоты?

По мнению главного конструктора компании «Акустическая заморозка» Дмитрия Балаболина, главное противоречие в существующей концепции криосохранения состоит в том, что глубокому охлаждению подвергается уже умерший мозг.

— Сейчас замораживать живого человека по закону нельзя, — поясняет Дмитрий Балаболин. — Но ведь если мы заморозим уже мертвый мозг, то что получим в итоге? На мой взгляд, применение криопротекторов подходит для хранения органов, например сердца, которое живет еще несколько часов после смерти человека. Но мозг надо замораживать, пока он еще жив, и в этом основная юридическая проблема, которая вряд ли будет решена в ближайшее время.

По мнению разработчиков, акустическая заморозка могла бы стать альтернативой криопротекторам. Они уже провели успешный эксперимент по заморозке и дальнейшему оживлению червей-нематод. Их заморозили и хранили две недели при температуре –18°C — после разморозки выжило 95%. При шоковой заморозке черви не выживали.

Проверенные криопротекторы

— Акустическая заморозка — отличный метод для сохранения структуры продуктов, — считает футуролог Валерия Прайд. — Но когда крионируют тела людей и животных, их держат при –196°C. Неизвестно, как поведет себя «акустический лед» при такой низкой температуре. Этот суровый «мороз» необходим для полной остановки биохимических процессов.

По словам заместителя генди⁠ректора компании «КриоРус» Ивана Степина, есть еще один важный недостаток акустической заморозки — образование кристаллов льда.

— Конечно, их меньше, чем при обычной заморозке, — говорит Иван Степин. — Однако наш мозг, то есть самое главное, что нужно сохранить у человека, является очень хрупким объектом. И даже небольшие и редкие кристаллы могут повредить структуру нейронов. Возможно, у акустической заморозки есть потенциал как минимум в хранении органов, но для окончательных выводов нужны дополнительные исследования. Так что пока мы будем пользоваться проверенным методом — криопротекторами.

От собаки до шиншиллы

Как рассказал «Известиям» Иван Степин, его компанией заморожено 64 умерших человека из разных стран, половину из них составляют граждане постсоветского пространства. Восемь лет назад была крионирована скончавшаяся от рака искусствовед Ксения Богемская. Спустя всего 14 часов после смерти был начат процесс перфузии мозга, а после его завершения — заморозка. Также среди замороженных граждане Италии, Японии, Франции, Нидерландов, Израиля, Индии, Австралии, Америки. Из-за сложности юридических процедур перфузию иностранных граждан не всегда успевают провести и прибегают к обычной заморозке. В США существуют две компании, предоставляющие услуги крионики, но некоторые американцы предпочитают обратиться в российскую.

В хранилищах, разбросанных по нескольким городам России, есть и 29 домашних питомцев. В основном собаки и кошки, но есть, например, шиншилла. По количеству крионированных животных лидирует Москва.

Большая часть замороженных ждет возможного «воскрешения» в подмосковном Сергиевом Посаде.

По словам главного научного сотрудника лаборатории репродуктивной криобиологии Центра биотехнологии и молекулярной диагностики Всероссийского института животноводства имени академика Л.К. Эрнста Павла Кленовицкого, крионика, несмотря на все достижения науки, продолжает оставаться спорной технологией.

— Большой организм — даже кролика, и тем более человека — при нынешних технологиях невозможно охладить мгновенно и равномерно, — говорит эксперт. — Градиент температур приведет к разбалансировке химических процессов в клетке.

По мнению Кленовицкого, нереально сделать так, чтобы криопротектор заменил собой всю воду во всех клетках умершего человека. Тем не менее ученый согласен, что продолжать исследования и попытки в этом направлении стоит.

CAS-технология замораживания продуктов в России

Судя по всему, очень скоро аббревиатура CAS станет привычным для россиян знаком качества и первозданной свежести широчайшего спектра продуктов питания.

Что такое CAS -технология замораживания?

CAS – это сокращение слов от английского словосочетания CELLS ALIVE SYSTEM (система живых клеток). CAS – это запатентованное название и товарный знак оригинальной технологии быстрой заморозки продуктов питания и биологических тканей, разработанной японским изобретателем и бизнесменом Норио Овада (Norio Owada), президентом фирмы ABI Co., Ltd. .

Что происходит с продуктами при обычном замораживании

При замораживании пищевых продуктов имеют место существенные проблемы, влияющие на сроки хранения замороженных продуктов и их качество после размораживания.

Во-первых , это неравномерность промерзания объема замораживаемого продукта во времени. В соответствии с законами физики промерзание идет «с наружи внутрь», то есть от внешних границ продукта к его центру. Это процесс мог наблюдать каждый, кто морозил лед в домашних условиях. И совершенно не важно, относится ли это к целой туше коровы, кочану капусты или к отдельной клетке растительной или животной продукции. При этом с одной стороны, идет «вымещение» не успевающей замерзнуть в тканях и клетках воды за пределы клеток и тканей, что ведет к «высушиванию» продукта. С другой стороны, вода, остающаяся в тканях и клетках, начинает кристаллизоваться в твердый лед.

Температура точки фазового перехода воды из жидкого состояния в твердое (кристаллическое) выбрана в качестве нулевой отметки в шкале Цельсия, которая применяется в России, Европе и большинстве стран мира. После уменьшения температуры ниже этой отметки из молекул воды начинается формирование кристаллов льда. Пространственная форма этой кристаллической решетки обусловлена строением молекул воды и имеет две особенности.

Вторая особенность – при образовании кристаллов льда вода увеличивается в объеме. Это хорошо известный всем пример со стеклянной бутылкой воды из школьных учебников, разрывающейся при замерзании, и вечная проблема коммунальщиков в зимние морозы, связанная с «размораживанием» (разрывом труб) систем водоснабжения и отопления при авариях, когда из этих систем не удается вовремя слить воду и эта вода замерзает в трубах.

Острые лучи кристаллов льда, и увеличивающийся объем воды повреждают внутренние структуры клеток и их оболочки, а вытесненная из клеток вода, расширяясь при замерзании в межклеточном и межтканевом пространстве, дополнительно «прокалывает» и разрывает волокна растительных и животных продуктов, как говорится, на макроуровне.

Во-вторых, процесс замораживания является термическим процессом. Замораживание приостанавливает одни естественные биохимические процессы разрушения и порчи продукта, вызванные прекращением жизнедеятельности организма и окислительными процессами, в то же самое время, необратимо запускает другие биохимические процессы в самом замороженном продукте, которые дополнительно провоцируются разрушением внутриклеточных структур. Это неизбежно ухудшает его исходное качество и потребительские свойства. Следует иметь в виду, что чем медленнее идет промерзание продукта и клеток на всю глубину, тем более активно запускаются разрушительные биохимические процессы.

Это вызвано тем, что при обычном замерзании образующаяся кристаллическая решетка льда вытесняет в оставшуюся жидкую воду растворенные до этого во всем объеме вещества. Что непрерывно и резко повышает их концентрацию в остающемся объеме воды. Примерами вредных последствий возникновения таких дисбалансов в природе могут быть опреснение морей или повышение солености воды в реках и озерах, губительные для их флоры и фауны, или повышение кислотности желудочного сока (концентрации соляной кислоты) у человека, ведущее к гастритам и язвам.

Читать еще:  При серповидноклеточной анемии не нужно избегать тренировок

Для уменьшения указанных существенных проблем применяется глубокая (до — 80°С и ниже) шоковая заморозка. После промерзания продукта его можно хранить уже при более высоких температурах ( — 40 °С или — 60 °С). Это несколько увеличивает срок хранения замороженных продуктов и повышает качество их сохранности, но удорожает и замораживание, и само хранение, к тому же, не гарантирует высокое качество продукта после размораживания. Достаточно большое количество продуктов питания вообще не подлежат замораживанию, так как полностью теряют после размораживания все свои качественные показатели и становятся практически непригодными к употреблению в пищу.

Что происходит с клетками и тканями продуктов при использовании CAS — технологии замораживания и хранения

За счет практически мгновенного промерзания продукта удается сохранить в образовавшихся микрокристаллах льда и все полезные и растворенные в них вещества, что хорошо видно на приведенном фото. Это позволяет полностью сохранить воду и все растворенные в ней вещества внутри клеток и тканей замороженных продуктов, и избежать запуска необратимых биохимических процессов, вызванных изменениями концентрации растворенных веществ.
Помимо уже указанных достоинств системы CAS, есть еще одно достоинство. Оно состоит в том, что невозможное становится возможным. CAS-хранение позволяет уменьшить окисление на 98% (в зависимости от продукта) по сравнению с обычным хранением замороженных продуктов.

Другим выгодным преимуществом CAS -технологии является и более высокая, по сравнению с традиционными технологиями замораживания продуктов, температура их хранения(- 18°С вместо — 40°С или — 60°С). И все это при более длительных сроках хранения замороженных продуктов питания без малейшей потери их первоначального качества, не возможных при использовании других технологий замораживания и хранения замороженных продуктов. При этом CAS использует на 30% меньше энергии, чем обычные морозильные камеры и действует в несколько раз быстрее, в зависимости от типа продукта.

Демонстрацию того, как CAS-замораживание предотвращает образование кристаллов льда в переохлажденной до — 7 °С воде, а потом мгновенно обращает весь объем воды в лед простым ударом по стенке бутылки, можно видеть ниже на демонстрационном видео. Уровень воды остается неизменным, стекло целым, а вода – кристально чистой, за исключением нескольких пузырей!

Для достижения максимальных сроков хранения продуктов и биологических тканей, замороженных в CAS -морозильниках, необходимо использовать установки CAS-хранилища, которые используют тот же принцип генерирования слабых гармонических колебаний электромагнитного поля в продуктах питания. Для отдельных особо капризных видов продуктов питания бывает необходимо использовать установки CAS -размораживания.

Полевое воздействие CAS -технологии на атомы в пищевых продуктах, согласование магнитного момента электрона и магнитного потока устраняет любые бактерии, присутствующие в них (бактерии также замерзают, за исключением некоторых, но и они просто остаются в толще льда, без размножения).

CAS -системы не создают опасности для здоровья людей, так как они генерируют такое же количество энергии, как сотовые телефоны.

Гарантией качества CAS -технологии является ее применение в медицине

Несколько научных центров и университетов в Японии и за рубежом исследуют возможности применения CAS -технологии для сохранения донорских органов. В настоящее время японским специалистам удается сохранить жизнеспособность удаленных молочных зубов и зубов мудрости человека. В Японии создан и успешно функционирует первый в Мире коммерческий Банк зубов ( The Teeth Bank ) . Автором идеи применения CAS -технологии для сохранения зубов является доктор Тошитсугу Кавата ( Dr.Toshitsugu Kawata) , профессор факультета медицины и стоматологии Университета Хиросимы.

В Японии CAS -технология используется с конца 90-х годов. В настоящее время основной сферой ее применения является пищевая промышленность и медицина. По мнению президента Норио Овада , возможно применение этой технологии и в других инженерных и технических сферах. По источникам в сети Интернет, основной и самой широкой сферой применения CAS -технологии в самой Японии является пищевая промышленность, а именно сохранение пищевых продуктов (фрукты, овощи, молочные продукты, пекарное и кондитерское производство, мясо и мясные изделия, рыба и рыбопродукция, морские деликатесы и морепродукты) в состоянии «первозданной свежести».

CAS -технология компании ABI C о., LTD широко используется в Японии. Сама компания является поставщиком продуктов питания, сохраняемых с применением собственной технологии и производимого же ею оборудования. CAS -замораживание и хранение применяют в Корее, Китае, странах Юго-Восточной Азии, островных государствах ЮВА. Оценили преимущество CAS в странах Среднего Востока, в Северной Америке (Аляска, Мексика), в странах тихоокеанского побережья Южной Америки (Чили), а также в некоторых странах Западной и Северной Европы (Ирландия, Англия, Испания, Португалия, Франция, Италия, Норвегия). Маркетинговая стратегия компании ABI C о., LTD нацелена на дальнейшее расширение применения CAS -технологии в мире.

А что же Россия? До россиян информация о CAS -технологии шла очень долго. Еще дольше эта информация распространялась и проникала в умы российских бизнесменов. Судя по всему, в умы представителей власти эта информация пока еще не проникла вовсе. Вызвано это тем, что ABI C о., LTD активным продвижением своей технологии на российский рынок не занималась. Вообще, информации о CAS -технологии на русском языке очень мало. Не много ее и на английском языке.

В сети Интернет достаточное количество видеороликов и о Норио Овада, и о б ABI C о., LTD, и о CAS -технологии и ее достоинствах. Проблема в том, что все эти ролики имеют титры и озвучены на совершенно непонятных для большинства россиян языках планеты: японском, китайском, арабском, вьетнамском, каких-то других азиатских языках. Единственный ролик на европейском языке и тот сделан на португальском. Понять что-либо из надписей на упаковках продуктов с японскими иероглифами, демонстрируемых в видео, для россиян и других европейцев тоже проблематично. Плюс к этому японцы не очень озабочены созданием страниц с переводами своих сайтов хотя бы на английский язык.

Первым, кто широко поведал миру о Норио Овада и CAS -технологии на английском языке, стал журнал «Forbs » в 2008 году. Приблизительно в тоже время ABI C о., LTD издала на английском языке свою брошюру «CAS – CELLS ALIVE SYSTEM. The CAS Energy Function has an international patent». После чего интерес к технологии начали проявлять и профильные российские издания в области холодильного и морозильного оборудования и техники.

Про российскую разработку конкурирующей технологии AEF Бережная заморозка «Живой вкус» читать здесь >>.

Замораживание животных тканей и клеточных культур

Длительное сохранение жизнеспособности изолированных тканей и клеток, животных с
давних времен интересовало биологов разного профиля. Однако лишь в последнее время
эта проблема нашла свое практическое разрешение. С этой точки зрения наибольшего
внимания заслуживает методика длительного консервирования тканей, предназначенных для трансплантации и культивирования вне организма, а также сохранения ценных
штаммов перевиваемых культур клеток. Трудность использования замораживания для
сохранения жизнеспособности клеток животных обусловлена появлением внутри клеток
льда, который чаще всего приводит к разрушению и гибели последних. Сохранение нор-
мальной физиологической активности тканей в процессе замораживания и оттаивания
обеспечивается защитными жидкостями, лучшие результаты среди которых дает глицерин.
Защитное действие растворов декстрозы, сыворотки и соли более слабое, чем глицерина, в
процессе замораживания животных клеток. В последнее время в качестве стабилизаторов
при замораживании тканей стали использовать диметилсульфоксид, поливинилпирролидон, маннитол, этиленгликоль.

Читать еще:  Стиральная машина распространила супербактерию среди младенцев

В настоящее время практически можно считать решенным вопрос консервирования
замораживанием ткани яичника, семенников, щитовидной и паращитовидной желез,
селезенки и костного мозга, кусочков кожи, коры надпочечников и роговицы глаза.

Большинство исследователей приходят к выводу, что жизнеспособность живых клеток
сохраняется только при медленном замораживании тканей, обработанных 15-30%-ным
глицерином. Более высокие концентрации глицерина токсически действуют на клетки при
замораживании.

Независимо от скорости замораживание без глицерина, этиленгликоля или подобных им
по действию других веществ, как правило, лишает жизнеспособности животные клетки.

Для обеспечения жизнеспособности ткани, предназначенной для трансплантации,
необходимо соблюдать следующие условия.

1. Кусочки тканей выдерживать в 15- или 30%-ном растворе глицерина на нормальной
сыворотке, растворе Тироде или физиологическом растворе хлористого натрия от
нескольких минут до 6-12 часов, что зависит от величины кусочков тканей. При этом
соблюдать все условия стерильности. После погружения кусочков ткани при 18-25° раствор
глицерина охлаждать до 2-4° со скоростью 1° в минуту.

2. Дальше, охлаждать ткани можно в защитном растворе глицерина или отдельно от него
в стерильных стеклянных сосудах с притертыми пробками. Замораживать до -16-20°
рекомендуется медленно — со скоростью не более 1° в минуту. В дальнейшем понижать
температуру быстрее — не менее 10 в минуту.

3. Температура хранения замороженной ткани не должна превышать -70°. Оптимальной
для хранения ткани считается температура в пределах -110-120 .

4. Температура хранения замороженной ткани должна быть стабильной, колебания ее
не должны превышать 1-2°.

5. Сосуды с замороженной тканью должны быть герметически закрыты во избежание инфицирования и высушивания.

6. Оттаивание необходимо производить быстро, погружая сосуд с замороженной тканью в воду, подогретую до 35-40°.

Размороженную ткань освобождают от глицерина, отмывая ее в растворе Тироде,
Хэнкса, нормальной сыворотке или физиологическом растворе хлористого натрия (рН 7,2-
7,4) путем последовательного перенесения в 3-4 сосуда с небольшим количеством
указанных жидкостей.

Освобожденные от глицерина кусочки тканей используют для трансплантации.
Основным критерием оценки выживаемости животных клеток являются скорость
приживляемости трансплантатов и степень регенерации пересаженных тканей.

С познавательной и особенно с практической точки зрения исключительный интерес
представляет проблема сохранения перевиваемых и диплоидных линий клеток, поскольку
срок переживания их при положительной температуре весьма ограничен. Ряду
исследователей удавалось сохранять различные линии клеток при 4° не более 30-35 дней в
питательной среде, содержащей 10-15% сыворотки. Более длительное хранение приводило
к разрушению клеток и потере их жизнеспособности. Периодическое субкультивирование
культур клеток через каждые 4-5 недель хранения при 4° позволяет сохранять жизнеспособность перевиваемых клеточных линий до 5-7 месяцев. Однако это весьма
громоздкий и малонадежный метод длительного хранения клеточных культур.

Открытие защитного действия глицерина, диметилсульфоксида, а также маннитола
позволило разработать методы хранения культур тканей в замороженном состоянии. Сейчас
среди перечисленных препаратов наиболее широко применяется глицерин. Сочетание
обработки клеток глицерином с двухэтапным их охлаждением до -70 и -190° позволяет
сохранять жизнеспособность культур тканей от 4 месяцев до года и более.

Для замораживания клеточных культур можно использовать сухой лед со спиртом или
холодильники с программированным охлаждением до -70, -130°. Хранение
культур клеток осуществляют в смеси спирта с сухим льдом (-78°), в установках с
жидким азотом или в низкотемпературных холодильниках, обеспечивающих поддержание
температуры в пределах от -70 до -130 . Для этой цели особенно удобен аппарат типа сосуда
Дьюара.

Культуры клеток обычно замораживают в обогащенных средах (в среде № 199 или среде
Игла) с 10-15% сыворотки животных и таким же количеством глицерина. Перед
замораживанием клетки снимают с матраса раствором версена, центрифугируют при 800-
1000 об/мин и осадок ресуспендируют в среде для консервации до концентрации 106,5-107
клеток в 1 мл. Взвесь клеток разливают по 1-2 мл в ампулы объемом 1,5-3 мл, которые
тотчас запаивают во избежание изменения рН среды и оставляют при комнатной
температуре на 30 минут — 1 час, с целью проникновения глицерина внутрь клеток. После
этого ампулы с клетками помещают в сосуд со спиртом и под контролем термометра вносят
кусочки сухого льда с таким расчетом, чтобы температура равномерно понижалась на 1° в
минуту.

После снижения температуры с 20 до -10-12 возможно временное обратное оттаивание,
поэтому скорость охлаждения необходимо повысить до 1,5-2 в минуту, а после достижения
-18-20° скорость охлаждения можно доводить до 5 в минуту. Хранение замороженных
клеток можно осуществлять в холодильных камерах при -70-100°, в сосудах Дьюара или в
специальных установках с жидким азотом при -196°, а также в термосах, заполненных
смесью сухого льда со спиртом, которые желательно хранить в холодильниках при -25-30°.
В термосы периодически подкладывают сухой лед для поддержания постоянной
температуры на уровне не ниже -70°. Оттаивание замороженных клеток необходимо произ-
водить очень быстро (3-5° в секунду) путем погружения ампул в водяную баню, подогретую
до 38-40°. После оттаивания ампулы с клетками центрифугируются последовательной
двукратной сменой питательной среды с целью удаления глицерина. В последние годы
для сохранения клеток при замораживании взамен глицерина стали использовать
диметилсульфоксид. Перед замораживанием клетки суспендируют в основной питательной
среде, содержащей 15% бычьей сыворотки. К этой массе добавляют 10-15% по объему
диметилсульфоксида. Замораживают и оттаивают клеточные взвеси так же, как и в среде с
глицерином. Хранят клетки при -65° и более низких температурах в течение 6 месяцев и
дольше.

О сохранении жизнеспособности клеток можно судить по их отношению к
окрашиванию трипановым синим: жизнеспособные клетки не окрашиваются, а нежиз-
неспособные легко воспринимают окраску. Для этого 1 мл суспензии клеток смешивают
с 0,5 мл 0,5%-ного раствора трипанового синего. После этого под микроскопом в
камере Горяева производится четырехкратный подсчет количества окрашенных и
неокрашенных клеток. Окончательную оценку жизнеспособности клеток дает результат
их роста и образования монослоя ин витро в питательной среде.

Ссылка на основную публикацию
Статьи c упоминанием слов:
Adblock
detector